动脉血栓是心肌梗死和缺血性中风的主要诱因。血小板活化在血栓形成中扮演核心角色，因此抑制血小板功能成为治疗动脉血栓的关键策略。目前临床常用的抗血小板药物包括环氧化酶抑制剂、ADP受体拮抗剂等，但这些药物存在出血风险或疗效局限。天然产物因其副作用较小的特点受到关注。

瑞香素是从瑞香属植物中提取的香豆素衍生物，在国内已被用于治疗凝血性疾病，但其抗血小板作用的分子机制尚未明确。一项发表于International Journal of Molecular Sciences的研究揭示了瑞香素通过调控细胞质磷脂酶A₂（cPLA₂）磷酸化减少血栓素A₂生成，从而抑制血小板活化的新机制。

研究目的

本研究旨在利用小鼠血小板模型，探讨瑞香素对血小板功能的影响，阐明其调节血小板活化的分子机制，特别是瑞香素是否通过影响血栓素A₂生成及相关信号通路来发挥抗血小板作用。

研究方法

研究采用C57BL/6小鼠，分离洗涤血小板。使用Lumi-aggregometer检测血小板聚集和致密颗粒分泌（通过ATP释放监测）。采用ELISA试剂盒测量血栓素B₂（血栓素A₂的稳定代谢物）生成量。通过免疫印迹法检测cPLA₂、ERK和AKT的磷酸化水平。实验中使用了胶原、2-甲硫基腺苷二磷酸（2-MeSADP）和凝血酶作为血小板激动剂，部分实验用阿司匹林预处理血小板以阻断血栓素A₂生成。

研究结果

瑞香素对GPVI介导的血小板反应影响较小。研究首先用不同浓度胶原刺激血小板。瑞香素以剂量依赖方式抑制了致密颗粒分泌，但仅在高浓度下才显著抑制血小板聚集。这与秦皮乙素等其他香豆素衍生物不同，后者能够强力阻断胶原诱导的聚集。提示瑞香素在GPVI信号通路中作用有限。

注：（A）在不同浓度的瑞香素存在下，用GPVI激动剂3 ţg/ml、5 ţg/ml和7.5ţg/ml的胶原刺激洗涤后的小鼠血小板3.5min。在 Lumi-aggregometer中分析血小板聚集（上）和ATP分泌（下）。数据代表三次独立实验（n=3）。对图A中的（B）聚集程度和（C）致密颗粒分泌进行定量。（B）聚集程度和（C）致密颗粒分泌的数据表示为平均值$F_{22}$ ś标准误 *，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.005；****，P＜0.0001

图1 瑞香素对胶原诱导的血小板聚集和分泌的影响

瑞香素完全抑制2-MeSADP诱导的二次聚集和分泌波。使用ADP类似物2-MeSADP刺激血小板时，瑞香素完全抑制了低浓度和高浓度诱导的二次聚集波以及致密颗粒分泌。已知二次聚集波依赖于血栓素A₂的正反馈效应。为了验证这一点，研究者用阿司匹林预处理血小板以阻断血栓素A₂生成。在阿司匹林处理后的血小板中，瑞香素不再对2-MeSADP诱导的聚集产生额外抑制作用。这说明瑞香素的作用靶点正是血栓素A₂的生成过程。

注：（A）在不同浓度的瑞香素存在下，用30 nM、50 nM和100 nM的2-MeSADP刺激洗涤过的小鼠血小板。所有数据均代表三次独立实验的结果（n=3）。对图A中的（B）聚集程度和（C）致密颗粒分泌进行定量分析。数据以平均值±ś标准误***表示，P＜0.001；****，P＜0.0001

图2  瑞香素对非阿司匹林化血小板中2-甲硫基腺苷二磷酸诱导的聚集和分泌的影响

瑞香素仅抑制低浓度凝血酶诱导的血小板活化。凝血酶是更强的血小板激动剂。低浓度凝血酶诱导的聚集和分泌依赖血栓素A₂的正反馈，而高浓度凝血酶不依赖这些信号。结果显示，瑞香素仅抑制了低浓度凝血酶诱导的聚集和分泌，对高浓度凝血酶无影响。这进一步支持瑞香素通过阻断血栓素A₂生成来发挥作用。

注：（A）在不同浓度的瑞香素存在下，用0.1 U/ml、0.3 U/ml和0.5 U/ml的凝血酶刺激洗涤过的小鼠血小板。对图A中的（B）聚集程度和（C）致密颗粒分泌进行定量。数据代表三次独立实验（n=3），以平均值±ś标准误*表示，P＜0.05；**，P＜0.01；****，P＜0.0001

图3  瑞香素对凝血酶诱导的血小板聚集和分泌的影响

瑞香素显著减少血栓素A₂生成。研究直接测量了血小板中血栓素B₂的水平。瑞香素以剂量依赖方式显著抑制了2-MeSADP和凝血酶诱导的血栓素B₂生成，证实了其对血栓素A₂合成通路的阻断作用。

注：洗涤后的小鼠血小板在37下，在不同浓度的瑞香素存在下，分别用（A）100 nM 2-MeSADP和（B）0.1 U/ml和0.5 U/ml凝血酶刺激3.5min，并在搅拌条件下，通过酶联免疫吸附测定法重复测量TxB₂生成量。数据代表三次独立实验（n=3），并以平均值±ś标准误**P＜0.01***，P＜0.001；****P＜0.0001表示

图4  瑞香素对2-甲硫基-腺苷二磷酸和凝血酶诱导的血小板中血栓素A₂生成的影响

瑞香素直接抑制cPLA₂磷酸化，对ERK的抑制是间接效应。在未用阿司匹林处理的血小板中，2-MeSADP诱导的cPLA₂磷酸化和细胞外信号调节激酶磷酸化均被瑞香素抑制。在使用阿司匹林阻断血栓素A₂生成后，瑞香素仍然完全抑制cPLA₂磷酸化，但对ERK磷酸化没有影响。这表明瑞香素直接靶向cPLA₂磷酸化，而非通过ERK间接发挥作用。瑞香素对ERK磷酸化的抑制实际上是血栓素A₂生成减少后的下游结果。此外，瑞香素不影响蛋白激酶B磷酸化，排除了PI3K-AKT通路的参与。

注：（A）在37下，用不同浓度的瑞香素处理洗涤后的血小板，并在100 nM 2-MeSADP的刺激下孵育2min。加载对应于相同数量血小板的裂解液体积。用抗磷酸化cPLA₂、抗cPLA₂、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗磷酸化AKT或抗AKT抗体检测膜。所示数据代表三次独立实验（n=3）。对（B）非阿司匹林处理和（C）阿司匹林处理的血小板中的印迹进行定量，并以平均值±ś标准误表示，***，P＜0.001；****，P＜0.0001

图5  瑞香素对2-甲硫基腺苷二磷酸诱导的血小板中cPLA₂和ERK磷酸化的影响

综上，瑞香素通过直接抑制cPLA₂磷酸化，减少花生四烯酸释放，从而降低血栓素A₂生成。血栓素A₂减少又削弱了对血小板的正反馈激活，最终抑制了由ADP和低浓度凝血酶诱导的血小板聚集和分泌。这项研究首次阐明了瑞香素抗血小板作用的分子基础，将其作用机制定位于cPLA₂磷酸化这一环节，为开发新型抗血栓药物提供了潜在先导化合物。

参考文献

Chaudhary，P.K.，Kim，S，Kim,，S.瑞香素在小鼠体内的抗血小板作用受cPLA₂介导的血栓素A₂生成的调控[J].Int.J.Mol.Sci，2023，24：5779.